Τι μας λέει η μελέτη, από έναν εξαιρετικό επιδημιολόγο;
Οτι ο ιός μεταδίδεται μόνο απο 0 έως 8 ημέρες από την έναρξη των συμπτωμάτων, μετά από 8 ημέρες, δεν εντοπίστηκε ζωντανός ιός, αλλά το τέστ θα σε βγάλει θετικό ακόμα και μετά από πολλές εβδομάδες.
Το ιικό RNA μπορεί να ανιχνευθεί αρκετό καιρό μετά την εξαφάνιση του μολυσματικού ιού.
Και αυτό που μετράει η PCR , είναι ιικό RNA και όχι ιό.
Επίσης όταν ανιχνευθούν αντισώματα εξουδετέρωσης στον ορό, ο ιός καθίσταται μη μολυσματικός.
Η ανίχνευση ιών μέσω της PCR είναι χρήσιμη εφόσον μπορεί να γίνει κατανοητή η ακρίβεια: προσφέρει την ικανότητα ανίχνευσης RNA σε ελάχιστες ποσότητες, αλλά αν το RNA αντιπροσωπεύει μολυσματικό ιό μπορεί να μην είναι σαφές.
Κατά τη διάρκεια του Open Evidence Review της από του στόματος-κοπράνων μετάδοσης του Covid-19, παρατηρήσαμε πόσο λίγες μελέτες είχαν προσπαθήσει ή αναφέρει την καλλιέργεια ζωντανού ιού SARS-CoV-2 από ανθρώπινα δείγματα.
Αυτό μας εξέπληξε, καθώς η ιογενής καλλιέργεια θεωρείται ως το χρυσό πρότυπο ή το τεστ αναφοράς κατά του οποίου πρέπει να μετρηθεί και να βαθμονομηθεί οποιοδήποτε διαγνωστικό τέστ δείκτη για ιούς, για να κατανοήσουμε τις προγνωστικές ιδιότητες αυτού του τέστ.
Στην ιική καλλιέργεια, οι ιοί εγχέονται στις εργαστηριακές κυτταρικές σειρές για να δούμε εάν προκαλούν βλάβη και θάνατο των κυττάρων, απελευθερώνοντας έτσι ένα ολόκληρο σύνολο νέων ιών που μπορούν να συνεχίσουν να μολύνουν άλλα κύτταρα.
Εξετάσαμε λοιπόν τα στοιχεία από μελέτες που ανέφεραν δεδομένα σχετικά με την ιική καλλιέργεια ή την απομόνωση, καθώς και την αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης (RT-PCR), για να κατανοήσουμε περισσότερα σχετικά με το κατά πόσο τα αποτελέσματα της PCR αντικατοπτρίζουν τη μολυσματικότητα.
Ιικές καλλιέργειες για την αξιολόγηση μολυσματικότητας COVID-19. Συστηματική αξιολόγηση.
Viral cultures for COVID-19 infectivity assessment. Systematic review. Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan medRxiv 2020.08.04.20167932; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932
Τι βρήκαμε;
Ψάξαμε για μελέτες που ανέφεραν καλλιέργεια ή απομόνωση του SARS-CoV-2 χρησιμοποιώντας δείγματα από ασθενείς Covid-19.
Εντοπίσαμε δεκατέσσερις μελέτες που κατάφεραν να καλλιεργήσουν ή να παρατηρήσουν εισβολή σε ιστό από τον SARS-CoV από διάφορα δείγματα από ασθενείς που είχαν διαγνωστεί με Covid-19. Η ποιότητα αυτών των μελετών ήταν μέτρια με την έλλειψη πρωτοκόλλων, τυποποιημένων μεθόδων και αναφορών.
Τα δεδομένα είναι ασαφή για το κατά πόσο τα αποτελέσματα της PCR σχετίζονται με τα αποτελέσματα της ιογενούς καλλιέργειας. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις για τη σχέση μεταξύ του χρόνου από τη συλλογή ενός δείγματος έως το τέστ, της σοβαρότητας των συμπτωμάτων και των πιθανοτήτων ότι κάποιος είναι μολυσματικός.
Μία από τις μελέτες που βρήκαμε (Bullard et al) διερεύνησε ιική καλλιέργεια σε δείγματα από μια ομάδα ασθενών και συνέκρινε τα αποτελέσματα με δεδομένα δοκιμής PCR και χρόνο έναρξης των συμπτωμάτων τους.
Το παρακάτω σχήμα που αναφέρεται στους Bullard δείχνει πώς η πιθανότητα μολυσματικού ιού SARS-CoV-2 είναι μεγαλύτερη (οι κόκκινες ράβδοι) όταν το όριο διακοπής του κύκλου είναι χαμηλότερο (η μπλε γραμμή) και όταν τα συμπτώματα για τον χρόνο δοκιμής είναι μικρότερα - μετά από 8 ημέρες, δεν εντοπίστηκε ζωντανός ιός.
Αποβολή μολυσματικού ιού σε νοσοκομειακούς ασθενείς με νόσο κορονοϊού-2019 (COVID-19): διάρκεια και βασικοί καθοριστικοί παράγοντες medRxiv 2020.06.08.20125310.
Ο Κάμπεν και οι συνεργάτες του μελέτησαν την αποβολή μολυσματικού ιού σε 129 νοσοκομειακούς ασθενείς με COVID-19. Η διάρκεια της αποβολής μολυσματικών ιών κυμαινόταν από 0 έως 20 ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων και η πιθανότητα ανίχνευσης μολυσματικού ιού μειώθηκε κάτω από 5% μετά από 15 ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων. Αναφέρουν επίσης ότι η ποσότητα του ιού σχετίζεται με την ανίχνευση μολυσματικών SARS-CoV-2, και όταν ανιχνευθούν αντισώματα εξουδετέρωσης στον ορό, ο ιός καθίσταται μη μολυσματικός.
Όταν τα δείγματα ελήφθησαν φαινόταν σημαντικά για ιική καλλιέργεια. Σε μια αναφορά περίπτωσης, το SARS-CoV-2 RT-PCR συνέχισε να ανιχνεύει τον ιό μέχρι την 63η ημέρα μετά την έναρξη των συμπτωμάτων, ενώ ο ιός μπορούσε να απομονωθεί μόνο από αναπνευστικά δείγματα που συλλέχθηκαν εντός των πρώτων 18 ημερών.
Σε μια ομάδα 59 ασθενών, η απόρριψη κοπράνων ήταν μεγαλύτερη μετά τη διακοπή της αναπνοής. Οι Gupta et al. w15 ανέφερε τη διάρκεια της αποβολής ιικού RNA στα κόπρανα μετά την κάθαρση των αναπνευστικών δειγμάτων κυμαινόταν από 1 έως 33 ημέρες και σε έναν ασθενή ήταν έως 47 ημέρες από την έναρξη των συμπτωμάτων.
Δεν ήταν δυνατή η ακριβής ποσοτική αξιολόγηση της συσχέτισης μεταξύ των αποτελεσμάτων της RT-PCR και του ποσοστού επιτυχίας της ιογενούς καλλιέργειας σε αυτές τις μελέτες. Αυτές οι μελέτες δεν είχαν επαρκές μέγεθος ούτε πραγματοποιήθηκαν με επαρκώς τυποποιημένο τρόπο και ενδέχεται να υπόκεινται σε προκατάληψη αναφοράς.
Επιπλέον, το πλαίσιο έχει σημασία. Το επίπεδο του ορίου διακοπής του κύκλου για την ανίχνευση ζωντανών ιών θα ποικίλλει ανάλογα με τη ρύθμιση (νοσοκομείο έναντι κοινότητας), ανάλογα με τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων και τη διάρκεια των συμπτωμάτων, καθώς και την ποιότητα της εξέτασης. Τα όρια διακοπής του κύκλου είναι οι χρόνοι που πρέπει να επαναληφθεί η δοκιμή ενίσχυσης για να έχει θετικό αποτέλεσμα. Όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση ιού τόσο χαμηλότεροι είναι οι κύκλοι ενίσχυσης.
Γιατί έχει σημασία το όριο διακοπής του κύκλου;
Η RT-PCR χρησιμοποιεί ένα ένζυμο που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση για να αλλάξει ένα συγκεκριμένο κομμάτι RNA σε ένα αντίστοιχο κομμάτι DNA. Στη συνέχεια, η PCR ενισχύει εκθετικά το DNA, διπλασιάζοντας ξανά τον αριθμό των μορίων. Ένα φθορίζον σήμα μπορεί να προσαρτηθεί στα αντίγραφα του DNA, και μια δοκιμή θεωρείται θετική όταν το φθορίζον σήμα ενισχύεται επαρκώς ώστε να είναι ανιχνεύσιμο.
Το όριο διακοπής του κύκλου (αναφέρεται ως η τιμή Ct) είναι ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης που απαιτούνται ώστε το σήμα φθορισμού να διασχίσει ένα ορισμένο όριο. Αυτό επιτρέπει την ενίσχυση και την ανίχνευση πολύ μικρών δειγμάτων RNA.
Όσο χαμηλότερο είναι το επίπεδο του ορίου του κύκλου, τόσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα του RNA (γενετικό υλικό) που υπάρχει στο δείγμα. Όσο υψηλότερος είναι ο αριθμός κύκλου, τόσο μικρότερο RNA υπάρχει στο δείγμα.
Τι σημαίνει αυτό;
Αυτό το πρόβλημα ανίχνευσης είναι πανταχού παρόν για την ανίχνευση ιών RNA. Το ιικό RNA SARS-CoV, MERS, Influenza Ebola και Zika μπορεί να ανιχνευθεί αρκετά μετά την εξαφάνιση του μολυσματικού ιού.
Το ανοσοποιητικό σύστημα λειτουργεί για την εξουδετέρωση του ιού και την πρόληψη περαιτέρω μόλυνσης. Ενώ ένα μολυσματικό στάδιο μπορεί να διαρκέσει περίπου μια εβδομάδα, επειδή το αδρανοποιημένο RNA υποβαθμίζεται αργά με την πάροδο του χρόνου, μπορεί να ανιχνευθεί ακόμα και πολλές εβδομάδες μετά την εξάλειψη της μολυσματικότητας.
Η ανίχνευση ιών μέσω PCR είναι χρήσιμη, εφόσον γίνονται κατανοητοί η περιορισμοί της. Αν και ανιχνεύει RNA σε ελάχιστες ποσότητες, πρέπει να δίνεται προσοχή στα αποτελέσματα, καθώς συχνά δεν ανιχνεύει μολυσματικό ιό.
Τι μπορούμε να συμπεράνουμε;
Αυτές οι μελέτες παρείχαν περιορισμένα δεδομένα μεταβλητής ποιότητας που τα αποτελέσματα PCR καθαυτά είναι απίθανο να προβλέψουν ιική καλλιέργεια από ανθρώπινα δείγματα. Μπορεί να έχει δοθεί ανεπαρκής προσοχή στον τρόπο με τον οποίο τα αποτελέσματα της PCR σχετίζονται με ασθένειες. Η σχέση με τη μολυσματικότητα είναι ασαφής και χρειάζονται περισσότερα δεδομένα για αυτό.
Εάν αυτό δεν είναι κατανοητό, τα αποτελέσματα της PCR μπορεί να οδηγήσουν σε περιορισμούς για μεγάλες ομάδες ατόμων που δεν παρουσιάζουν κίνδυνο μόλυνσης.
Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκοπές φορτίου RNA ιού: για να κατανοήσουμε ποιος είναι μολυσματικός, την έκταση τυχόν εστίας και για τον έλεγχο της μετάδοσης.
Ποιο είναι το επόμενο;
Η κριτική μας είναι μια κριτική ανοιχτής απόδειξης. Θα ενημερώσουμε τα ευρήματα καθώς διατίθενται επιπλέον αποδεικτικά στοιχεία. Υποβάλαμε το χειρόγραφο στον διακομιστή προεκτύπωσης MedRxiv. (δείτε εδώ) Θα συνεχίσουμε να αναζητούμε και να βρούμε περαιτέρω μελέτες (όπως οι Kampen et al) που θα συμπεριληφθούν στις ενημερώσεις.
Εν τω μεταξύ, εάν έχετε σχόλια, εάν έχετε να συμπεριλάβετε άλλες μελέτες, και ειδικά εάν έχετε διαγνωστεί ως μολυσμένοι ή μολυσματικοί, στείλτε τα στο tom.jefferson@conted.ox.ac.uk.
Θα διαβάσουμε όλα τα σχόλια αλλά δεν μπορούμε να υποσχεθούμε να απαντήσουμε.
πηγή